Le Roi Boo est un grand ennemi de Mario et Luigi. Il est la raison pour laquelle sont là, au château.
Il est le chef des Boo, à peine plus gros qu'eux sous sa forme initiale. Il a découvert un nouveau don : se matérialiser sous forme humaine. C'est lui qui a calculé la capture de Mario et son emprisonnement dans un tableau qu'il garde près de lui, c'est lui qui s'est employé à narguer Luigi en pensant qu'il s'aventurerait seul. Mais voyant le groupe arriver, il décida de leur donner du fil à retordre : faire apparaitre quelques un de leurs ennemis qui se joueraient de leur mettre des bâtons dans les roues, sauf que son don lui a fait défaut à grande échelle, et c'est aussi des adjuvants qu'il leur a offert.